在细胞培养过程中,凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为细胞污染,轻则实验结果出不来,重则祸及他人(实验室),前期投入的人力、物力、财力和长期的坚持都付诸东流。 01 细菌污染 特征: ◆ 细菌污染时细胞培养基可能在4-6小时呈现混浊。 ◆ 有时稍加震荡,便会有很多混浊物漂起。 02真菌污染 ◆ 有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物。 ◆ 若是念珠菌会呈卵圆状,在细胞周边生长。 青链霉素 制霉菌素三抗 细菌(如G+、G-)、 真菌(如:酵母菌、霉菌) 青链霉素 两性霉素B三抗 细菌(如G+、G-)、 真菌(如:酵母菌、霉菌) 03支原体污染 最小的微生物,无法通过光学显微镜看见,但可通过电镜观察到。 感染支原体的细胞,在某一时间点碎片突然增多,随着传代,细胞状态显著变差。 细胞支原体污染可通过气溶胶传播,影响同一细胞房其他细胞。 鉴定方法: PCR法、显色法、荧光染色法等。 示例1►EBTr (牛胚气管细胞) 感染了支原体的EBTr特征:1.由成纤维样逐渐变得类上皮样;2.质膜铺展,溃烂;3.轮廓不清,边界模糊;4.凋亡细胞过多。 示例2►HT1080 (人纤维肉瘤细胞) 04 黑胶虫污染 “黑胶虫”可寄生于动物细胞,也可以生存于培养基中,依靠细胞和培养基中的营养为生,并随细胞传代而传代,是一种异养生物。 镜下无法直接观察到。主要表现为细胞状态差,黑点和碎片多,布朗运动。通过检测发现主要为细胞支原体污染,部分为未知的增殖不明显的微生物污染。 二、改善个人操作及培养环境 01 清洁培养箱 02 整理洁净台 超净台不是储物箱,什么培养皿、各种规格的板子、枪头不要堆在超净台,会造成许多紫外线顾不到的卫生死角。 细胞房其他的桌面,同样切忌东西堆积如山,不要将酒精棉球、标签纸、牛皮纸买来后全部堆在细胞房,污染物一不小心“飘”进你的细胞培养板里,细胞就会死给你看! 03 严格无菌操作 细胞房这种卫生要求高的地方,人一旦多了救护增加许多不确定因素,难以保证试验在无菌条件下操作。出入试验室,实验服当风衣穿,不扣纽扣,不戴鞋套,犹入无人之境,来去自由;超净台做实验时,喜欢说话聊着做试验,殊不知你喷口气,里面就有很多细菌。 规范操作是避免污染的最有效方式。 细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋,并定期消毒。 专用物品只在培养间内使用,不得带出细胞房。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞。必要物品可暂时放置,其他实验用品用完即应移出,以利于气流的通畅。 培养细胞过程中使用的所有实验用具,如移液管、一次性枪头、一次性塑料离心管、冻存管等需121°C高压灭菌20分钟后烤干备用,一些玻璃器皿如细胞培养瓶等须先泡酸、洗净、晾干后再高压灭菌。
一、判定细胞污染类并处理
◆ 在显微镜下呈黑色细沙状,或背景有大量黑点。
细菌污染可能造成细胞增殖缓慢或形态上的改变(多角、多核等),胞质中产生空泡、细胞漂浮凋亡。
处理方法:
抗生素
作用对象
使用比例
储存条件
卡那霉素溶液
细菌(如G+、G-、支原体)
稀释:1:100
-20℃
硫酸庆大霉素溶液
细菌(如G+、G-、支原体)
稀释:1:1000
AMB(15-30℃)
青链双抗
细菌(如G+、G-)
稀释:1:100
-20℃
青链双抗,10浓缩液
细菌(如G+、G-)
稀释:1:1000
-20℃
细菌(如G+、G-)、
真菌(如:酵母菌、霉菌)
稀释:1:100
-20℃
细菌(如G+、G-)、
真菌(如:酵母菌、霉菌)
稀释:1:100
-20℃
青链霉素,新霉素三抗
细菌(如G+、G-)
稀释:1:100
-20℃
轻度细菌污染可用10X双抗清洗处理,重度细菌污染建议消杀后丢弃。
特征:
根霉菌
◆ 早期并不会使得培养基变黄变浑浊,但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌形成的菌丝呈丝状,管状,树枝状,串珠状。
酵母菌
◆ 酵母菌等,当其行出芽生殖时可从一大一小的连体结构识别。
抗生素
作用对象
使用比例
储存条件
两性霉素B
真菌(如:酵母菌、霉菌)
稀释:1:1000-1:10,000
-20℃
制霉菌素
真菌(如:酵母菌、霉菌)
稀释:1:100-1:1000
-20℃
稀释: 1:100
-20℃
稀释: 1:100
-20℃
感染支原体的EBTr (牛胚气管细胞)(成纤维样)
被支原体“附身”的HT1080
甩掉支原体的HT1080
细胞污染,你能做的那些事儿
作者:无锡耐思生命科技股份有限公司 2023-05-30T14:32 (访问量:4810)
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