ELISA，它来啦~ 本期小 M 为您介绍 ELISA 的定义及原理、类型、及其优缺点。当然还有大家需要的 Protocol 方案、失败的可能性原因、解决方案、以及应用~
01
酶联免疫吸附试验 (ELISA)
酶联免疫吸附试验 (ELISA)，一种广泛用于基础科学研究、临床应用研究和诊断的免疫学检测方法。
原理：
ELISA 技术依赖于抗原 (即靶蛋白) 与针对目标抗原的一抗之间的相互作用，通过酶联抗体催化添加的底物来确认抗原的存在。
在 ELISA 中，将具有特定结合特性的液体样品添加到反应室或微孔板内的固定固相上。然后，依次孵育不同的液体试剂，从而在最终液体中产生一些光学变化 (例如，通过酶促反应产物的颜色变化)。其结果可以通过目视检查定性检测，也可以使用光度计或分光光度计的读数定量检测[1][2][3][4]。
本期我们介绍常见的三种 ELISA 类型：直接 ELISA (Direct ELISA)、间接 ELISA (Indirect ELISA) 和夹心 ELISA (Sandwich ELISA)。
图 1. 常见的三种 ELISA 类型[1]。
a. 直接 ELISA 依赖于酶偶联的一抗与抗原包被板的结合。b. 间接 ELISA 引入了对与抗原包被板结合的一抗具有特异性的酶联二抗。c. 夹心 ELISA 技术包括将样品抗原引入抗体预包被的板中，然后检测和酶联二抗依次结合到抗原上的识别位点。
02
ELISA 的实验方案
ELISA 实验通常分为几个步骤：包被、封闭、孵育、检测和结果分析。 SO，接下来小 M 为大家带来实验必备的 Protocol!
直接 ELISA
直接 ELISA 是检测抗原的最简单的方案。
将含有分析物的缓冲溶液加入 96 孔板中，让其粘附在塑料板上一段时间 (图 2a)。在直接 ELISA 中，加入带有偶联酶的一级检测抗体，该抗体与覆盖孔的抗原结合 (图 2b)。将板孵育足够长的时间以使抗原-抗体结合，并用磷酸盐缓冲盐水清洗以去除多余的抗体，然后加入酶的底物，在黑暗环境中等待酶-底物相互作用，然后用特定溶液停止反应。酶-底物相互作用导致颜色形成，可通过微孔板读数器检测到 (图 2c)。分析时，将样品读数与标准曲线进行比较。
图 2. 直接 ELISA 方案[3]。
基本操作：
一、包被：
(1) 包被抗原
向每孔加入 50–100 μL 预设浓度的抗原，封板后于 4 °C 孵育过夜。
(2) 洗涤
使用 ELISA 洗板机，用 0.05% PBST 缓冲液洗涤板三次。通过吸出或倒置板来填充和排空孔，以去除溶液。
二、封闭：
(3) 封闭
用含 3% BSA 的 PBS 缓冲液以 100–200 μL/孔的量封闭板，封板后于室温孵育 1 小时。
(4) 洗涤
按照步骤（2）进行洗涤。
三、孵育：
(5) 加入抗体偶联物溶液
加入抗体偶联物溶液 (Ab-HRP)，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 缓冲液中进行两倍系列稀释 (至少三个稀释度)。每个稀释度做三次重复。封板后于室温孵育 1 小时。
(6) 洗涤
去除溶液，并使用 ELISA 洗板机，用 0.05% PBST 缓冲液洗涤板六次。
(7) 显色
加入 TMB 底物溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，于室温孵育 7 分钟或直至达到所需的颜色强度 (标准品应出现明显的梯度)。
(8) 终止反应
向每孔加入 50 μL 2 M H2SO4 溶液来终止反应。
四、检测分析：
(9) 读板
使用具有适当硬件的 ELISA 板读数器测量吸光度。
(10) 数据分析
间接 ELISA
在间接 ELISA 中，抗原固定 (图 3a )、封闭和洗涤后，加入与抗原结合的一抗 (图 3b)。将载体在封闭缓冲液中孵育，使封闭缓冲液稀释的一抗结合到载体上，并用洗涤缓冲液洗涤，然后加入封闭缓冲液和带有酶标的第二抗体 (图 3c)。与直接 ELISA 类似，进行再次孵育、洗涤，加入底物，并使用微孔板读数器扫描孔 (图 3d)。
第二抗体也可以用荧光素标记，并使用荧光计在紫外光下对结果进行量化。这种方法称为荧光联免疫吸附试验(Fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA)。
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基本操作：
一、包被：
(1) 包被抗原
向每孔加入 50–100 μL 预设浓度的抗原，封板后于 4 °C 孵育过夜。
(2) 洗涤
使用 ELISA 洗板机，用 0.05% PBST 缓冲液洗涤板三次。通过吸出或倒置板来填充和排空孔，以去除溶液。
二、封闭：
(3) 封闭
用含 3% BSA 的 PBS 缓冲液以 100–200 μL/孔的量封闭板，封板后于室温孵育 1 小时。
(4) 洗涤
按照步骤（2）进行洗涤。
三、孵育：
(5) 加入一抗
加入一抗溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 缓冲液中进行两倍系列稀释 (至少三个稀释度)。每个稀释度做三次重复。封板后于室温孵育 1 小时。
(6) 洗涤
按照步骤（2）进行洗涤。
(7) 加入二抗
加入二抗溶液，如 Goat Anti-Human IgG H&L (HRP)，稀释于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 缓冲液中，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积。封板后于室温孵育 1 小时。
(8) 洗涤
去除溶液，并使用 ELISA 洗板机，用 0.05% PBST 缓冲液洗涤板六次。
(9) 显色
加入 TMB 底物溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，于室温孵育 7 分钟或直至达到所需的颜色强度 (标准品应出现明显的梯度)。
(10) 终止反应
向每孔加入 50 μL 2 M H2SO4 溶液来终止反应。
四、检测分析：
(11) 读板
使用具有适当硬件的 ELISA 板读数器测量吸光度。
(12) 数据分析
应用：
-
即时 HIV 检测 (Point-of-care HIV testing)：测试棒上标有 HIV 抗原，血液样本放在测试棒的末端。缓冲液允许任何抗体沿着棒子流动，并附着在抗原上。用抗人抗体 (二抗) 清洗，用偶联酶标记，然后用染料清洗。颜色的变化代表积极的结果[3]。
夹心 ELISA
夹心ELISA 可分析更复杂的溶液。其名称源于该装置能够将抗原“夹”在两种抗体之间 (图 4)。
将含有捕获抗体的包被缓冲液加入孔板中并使其粘附 (图 4a)。孵育后，清洗孔板并加入封闭缓冲液以封闭孔上任何剩余的结合位点。然后将样品加入每个孔中并孵育特定时间 (图 4b)。为确保结果的准确性，必须对每个孔板运行标准样品 (阳性对照) 和空白样品 (阴性对照)。然后将检测抗体加入每个孔中 (图 4c)，随后加入偶联的二抗和封闭缓冲液 (图 4d)。在每个步骤之间，用磷酸盐缓冲盐水清洗孔。加入底物溶液并使用微孔板读数器检测结果 (图 4e)。
基本操作：
一、包被：
(1) 包被捕获抗体
向每孔加入 50–100 μL 预设浓度的捕获抗体，封板后于 4 °C 孵育过夜或在室温下孵育 2 小时。
(2) 洗涤
在 ELISA 洗板机中用 0.05% PBST 缓冲液洗涤三次。通过吸出或倒置板来填充和排空孔，以去除溶液。
二、封闭：
(3) 封闭
使用含 3% BSA 的 PBS 缓冲液（100–200 μL/孔）封闭板，封板后于室温孵育 1 小时。
(4) 洗涤
按照步骤 (2) 进行洗涤。
三、孵育：
(5) 加入标准品和样品
向每孔加入 50–100 μL 标准品和样品，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 缓冲液中进行两倍系列稀释 (至少三个稀释度)。每个稀释度做三次重复。封板后于室温孵育 2 小时。
(6) 洗涤
去除溶液，并在 ELISA 洗板机中用 0.05% PBST 缓冲液洗涤六次。
(7) 加入一抗
加入另一种针对待测抗原不同表位的特异性检测抗体，稀释于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 缓冲液中，50–100 μL/孔，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积。封板后于室温孵育 1 小时。
(8) 加入二抗
加入二抗溶液，如 Goat Anti-Human IgG H&L (HRP)，稀释于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 缓冲液中，50–100 μL/孔，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积。封板后于室温孵育 1 小时。
(9) 洗涤
去除溶液，并在 ELISA 洗板机中用 0.05% PBST 缓冲液洗涤六次。
(10) 显色
加入 TMB 底物溶液，使用与步骤（1）相同体积的溶液体积，于室温孵育 7 分钟或直至达到所需的颜色强度 (标准品应出现明显的梯度)。
(11) 终止反应
向每孔加入 50 μL 2 M H2SO4 溶液来终止反应。
四、检测分析：
(12) 读板
使用具有适当硬件的 ELISA 板读数器测量吸光度。
(13) 数据分析
分析数据。
应用：
- 家用妊娠试剂盒 (Point-of-care pregnancy testing): 使用夹心 ELISA 法快速提供与患者相关的结果。试纸条含有抗 β 人绒毛膜促性腺激素 (抗 βhCG) 和结合抗体，这些抗体与尿液样本中的 βhCG 发生反应。用自来水冲洗试纸条以去除任何未结合的样本，并与底物试剂一起孵育几分钟。颜色信号的存在和强度与样本中的 βhCG 量成正比，可用于估计妊娠周龄。
03
如何做出更好的 ELISA 实验？
想要做好一个 ELISA 实验，确保结果的准确性和可靠性，除了基本的实验步骤外，还需要注意一系列细节和考虑因素。 以下是小 M 为大家补充的一些 ELISA 实验小细节：
But！胜败乃兵家常事，实验哪有不失败的~各位 “科研汪”们，想找出实验 Bug 的可能性原因？修复 Bug 还原“完美”数据？嘿嘿，戳下面~
表 2. 实验失败的可能性原因及解决方案[3]。
04
小结
本期小 M 为大家介绍了 ELISA 实验的相关知识，从原理、类型、Protocol、应用blabla.....还有哪些实验操作限制了你的课题进度？欢迎大家留言反馈给我们喔~
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参考文献：
[1] Konstantinou GN. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2017;1592:79-94.
[2] Hornbeck P, Winston SE, Fuller SA. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 11:Unit11.2.
[3] Tabatabaei MS, et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2022;2508:115-134. doi: 10.1007/978-1-0716-2376-3_10. PMID: 35737237.
[4] Hayrapetyan H, et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Types and Applications. Methods Mol Biol. 2023;2612:1-17.