TUNEL 法测凋亡操作步骤

                            Yuanmu

一、TUNEL检测原理

      TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

     其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。

二、试剂盒组份

       组   份          10 assays             25 assays               储存条件

A：Equilibration Buffer                           1.0 mL                  2.5 mL                    -20 ℃          

B：Biotinylated Nucleotide Mix               10 μL                    25 μL                     -20 ℃

C：TdT Enzyme                                    10 μL                    25 μL                     -20 ℃          

D：500×Proteinase K                      10 μL                    25 μL                     -20 ℃

       20×SSC                                       15 mL                   38 mL                     4 ℃

E：Streptavidin-HRP                              10 μL                   25 μL                       4 ℃

F：20×DAB Substrate Buffer                 50 μL                  125 μL                    4 ℃           

G：20×DAB Chromogen                       50 μL                  125 μL                   4 ℃

H：20×Hydrogen Peroxide                    50 μL                  125 μL                   4 ℃

三、操作流程

1.操作流程概览

2.细胞样本制备

准备：

    ● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。

    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；

    ● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇；

    ● 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；

操作步骤：

1)经过实验处理的细胞爬片或细胞涂片，自然晾干；

2)室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；

3)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；

4)浸入细胞膜通透液中，室温30sec~2min；

5)进行标记反应。

3.石蜡包埋组织切片预处理

准备：

    ● 石蜡切片脱蜡至水：二甲苯脱蜡2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；

    ● 蛋白酶K工作液：2 μL500×蛋白酶K + 998 μL PBS；

    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；

    ● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇。

操作步骤：

1)石蜡包埋的组织切片按常规方法脱蜡至水；

2)PBS漂洗3×5min；

3)加入蛋白酶K工作液，37℃反应15~30min；PBS漂洗3×5min；

4)（选择进行）室温固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；

5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min；

6)进行标记反应。

4.冰冻组织切片预处理

准备：

    ● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鲜配制；

    ● 封闭液：3%H2O2溶于甲醇；

    ● 细胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鲜配制；

操作步骤：

1)冰冻切片浸入固定液，室温固定10min；PBS漂洗3×5min；

2)浸入封闭液中，室温封闭10min；PBS漂洗3×5min；

3)浸入通透液中，室温30sec~2min；

4)进行标记反应。

5.阳性对照和阴性对照的准备

TUNEL检测时需要设立阳性对照和阴性对照，以显示实验的客观性和准确性。

1)阳性对照样本的处理（选择进行）

   DNaseI反应液（用户自备）： （10U-3000U DNase I；40mM Tris-HCl pH 7.9； 

                                                   10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）

组织样本经过蛋白酶K处理或者通透液处理，PBS浸洗后，加入100 μL DNaseI反应液，室温孵育10~30min，用去离子水彻底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，进行标记反应。

2)阴性对照样本的处理

   在进行标记反应过程配制TdT酶反应液时，不加入TdT酶，其余步骤相同。

四、标记和显色反应

以下操作在湿盒内进行。

1.预处理好的样本经过PBS漂洗后，用滤纸轻轻吸去样本周围液体；

2.每个样本滴加100 μL TdT酶反应液，于37＆#61616;C避光反应60min；

TdT酶反应液的准备（即用即配）：

  成分                                        标准100 μL/片        切片数        总体积

  Equilibration Buffer                    98 μL                     ×                =

  Biotinylated Nucleotide Mix        1 μL                      ×                =

  TdT Enzyme                             1 μL                      ×                =

阴性对照片不加TdT酶。

3.用去离子水按1：10稀释20×SSC，进行终止反应，室温15min；然后PBS漂洗3×5min；

4.浸入0.3%H2O2/PBS中封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3~5min；PBS漂洗3×5min；

5.滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀释为工作液），于37℃反应30~60min；

6.PBS漂洗3×5min；

7.滴加DAB显色液：

  成分                                         100 μL/片       切片数     总体积

  20×DAB Substrate Buffer             5                   ×             =

  20×DAB Chromogen                    5                   ×            =

  20×Hydrogen Peroxide                 5                  ×            =

  ddH2O                                        85                  ×            =

8.用去离子水漂洗数次；（选择进行复染细胞核）；

9.中性树胶封片，显微镜下观察。

注意事项：

1.PBS清洗后，请尽量去除PBS液体再进行下一步反应；

2.避免载波片上的样本干燥造成实验失败；

3.TdT酶反应液应即用即配，在冰上进行，不宜长期保存；

4.复染细胞核可以用甲基绿染液（用户自备）。

参照图