在阅读文献和进行实验的过程中，但凡涉及到分子表达的调控，我们总免不了听到一个技术那便是Cre-loxP技术，那么Cre-loxP到底是一个什么样的技术呢？跟着小编一起来了解一下吧。
Cre-loxP的基本原理
Cre-loxP重组是一种特定位点的重组酶技术，可以在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位以及倒位。该系统可以针对特定的细胞类型或者采用特定的外部刺激，对细胞中DNA进行改造，在真核和原核系统中都适用。
Cre（Cyclization Recombination Enzyme）：是一种重组酶，最早来源于P1噬菌体，属于λInt 酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp，编码38KDa蛋白质,由343个氨基酸组成。Cre重组酶可以识别特异性的DNA序列称之为loxP的序列，可以对两个loxP位点进行催化重组。
loxP位点：是位于P1噬菌体上由34个碱基组成的回文序列，是由13bp的反向重复序列和一个非对称的8bp间隔序列组成。
图1.Cre酶和loxP位点
Cre-loxP所介导的三种遗传物质重排的方式
当细胞基因组存在两个loxP位点的时候，一旦存在Cre酶会诱导loxP位点之间的序列发生重组。loxP位点的方向和位置决定了遗传物质将会以以下的几种方式进行重新排列：
1. 翻转：当两个loxP位点位于同一个染色体上并且方向相反时，两个loxP位点的序列将会在Cre酶的作用下发生序列翻转；
2. 缺失：当两个loxP位点在同一染色体上且方向相同时，两个loxP位点之间的序列将会在Cre酶的作用下被切除发生缺失；
3. 易位：两个loxP位点位于不同染色体上并且方向相同时，将会在Cre酶的作用下则会导致DNA链的交换或染色体易位。
图2. 遗传物质重排的三种方式
两种策略实现Cre依赖的基因表达
在序列只存在一对loxP位点的时候，在Cre酶的作用下，遗传物质重排的方式是可逆的，如何使他们达到稳定？我们可以通过下面的两种策略实现Cre依赖的基因表达。
1. DIO序列策略
DIO序列策略的关键在于引入两对不同的lox位点：LoxP和Lox2272。在Cre酶的作用下，不论是识别LoxP还是Lox2272位点，第一步都可以实现目标基因的反转。反转会使两个loxP位点或者Lox2272位点变成同向。第二步在Cre酶的作用下，剪切删除一个LoxP位点和一个Lox2272位点，进而实现基因的稳定表达。
图3.DIO序列策略原理
2. LSL序列策略
LSL序列策略是将LoxP和转录中止盒插入启动子和目的基因中间，构成转录“终止盒”（Lox-stop-Lox），这个“终止盒”能够终止基因的转录。在没有Cre酶的作用下，转录终止盒下游靶基因完全不表达。但是如果细胞中有Cre酶，终止盒会被Cre酶切除，从而实现组织特异性的基因过表达。
图4.LSL序列策略原理
Cre-loxP系统的优点
1. 高效性：不会受靶基因大小和位置的影响，有研究表明两个loxP之间的距离在1.5-3.5kb之间时，敲除效率可以达到99%。
2. 时空特异性：除了实现目的基因在特定组织（利用组织特异性启动子+Cre）中的改造之外，还可以实现目的基因在特定时间的表达，具体的方法就是更加精准的诱导型Cre-loxP系统，这一部分将会在下期接着和大家做进一步说明；
3. 应用范围广：在不同的靶器官和各种生理条件下都适用。
Cre-loxP系统的应用-基因敲除鼠的繁育
基于Cre-loxP系统的种种优点，研究人员们将它应用到科学研究中实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，原理如下图所示。首先需要两只转基因小鼠。第一只转基因小鼠的获得是在体外构建一个目的基因两端含有loxP位点的基因序列，将这段序列转入胚胎干细胞内。通过同源重组技术替代野生型的细胞的基因序列。通过胚胎干细胞技术处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终得到特定位点含有loxP的转基因小鼠。第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。想要或者KO的小鼠，需要在Cre小鼠和Floxp小鼠杂交得到后代F1的基础上和野生型小鼠进一步进行杂交。
图5.基因敲除鼠的繁育过程
转基因动物的缺点
1. 时间周期长：转基因小鼠很难获得，虽然现在已经有很多的Cre和loxP转基因动物，但是因为时间和成本的原因，转基因动物本身就很难获得。其次获得转基因动物之后，需要将转基因动物进行交配，至少两代才能获得基因敲除的小鼠，交配一代至少需要2个月的时间，所以至少需要半年才能拿到基因敲除的小鼠。
2. 组织特异性不高：转基因小鼠所依赖的基因敲除只能依赖于启动子的调控，而有些启动子并不能实现组织特异性的表达，这样就会使得组织特异性不高影响实验准确性。
所以说想要更加省时间、省费用的人为操控基因的表达和过表达和敲定，我们在转基因动物的基础上需要利用Cre-loxP技术去发展出更加高效的科研工具。工具病毒应运而生，关于科研病毒的使用将在下一期进行讲解，希望大家持续关注。
公众号底部菜单栏【新功能】上线！
病毒实验帮
免费在线学习《国自然热点研究》、《数据库及软件操作教程》
一键下载《病毒使用手册》、《高分文献》
还有不定时的送新书、抽奖活动，赶紧来扫码关注一波吧