IHC是一项具有挑战性的应用技术，应用过程中常出现各种问题，例如检测结果阴性，非特异性染色，染色强度不够，着色不均，脱片，干片等。因此索莱宝为大家总结了一些IHC常见问题及处理方法，来帮助您改进IHC检测，减少您的实验优化过程，快速达到预期结果。

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a）甲醛：甲醛是保留组织和细胞内蛋白靶点的最常用固定剂，是大多数IHC/ICC应用的良好选择，但并不是一种通用的固定剂。醛的过度固定会修饰氨基酸（属于表位中的一部分），并阻断抗体与之结合。然而大部分情况下，利用抗原修复技术可暴露表位，以还原抗体结合。研究表明甲醛会诱导磷酸化依赖表位的细胞内转位，从细胞膜转移至细胞质。在这种情况下，冰预冷的无水甲醇或无水乙醇是适当的替代。

b）醇类：最常用于细胞和组织固定的醇类是甲醇和乙醇。通常认为醇类不像甲醛固定剂那样保留组织形态，不像甲醛那样渗透，主要用于固定冰冻组织切片和细胞。在醇类固定之后不推荐进行抗原修复。

c）丙酮：丙酮是一种强的脱水剂，能引起组织蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷冻组织的切片。

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a）培养细胞：培养细胞的固定时间与组织相比较短，且固定液的浓度更低。例如，用2%甲醛溶液在室温下固定20min，足以保留细胞形态和抗原性。

培养细胞的固定通常只是去除培养基，并加入固定液即可。不过，去除培养基后表面张力的变化可能损害某些细胞类型。如果是这种情况，固定剂可直接加入培养基中。例如，加入与培养基相同体积的4%甲醛，将得到2%甲醛溶液，它足以预固定细胞。2min后，预固定培养基应当替换成新鲜的2%固定剂。预固定步骤让细胞更加坚硬，这样它们就能够承受表面张力改变所引起的任何可能的有害影响。

b）组织：对于小组织来说，浸入固定溶液通常能获得足够的固定。可将解剖的组织浸润在固定剂中，但是如果将固定溶液经由内循环系统（无论是通过心脏或通过腹主动脉）灌注，则往往能获得更快速、更均匀的固定。在研究小动物的完整组织时，灌注固定是保留抗原的最佳方法，包括用固定液来取代动物的全身血液。4%甲醛是组织灌注和浸润固定的常用溶液。

为了在浸润固定过程中加强固定剂的渗透，建议组织厚度不超过5mm。对于完整的固定，固定剂的体积应当是组织体积的50-100倍。固定通常在室温下进行4-24小时。由于固定不足或固定过度可能降低或破坏组织的免疫反应性，因此优化条件很重要。

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由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇，通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方式一般分三种：高压修复、微波修复、酶修复。

a）高压修复是目前使用较多、较稳定、可重复性较高的一种方法，操作简单，效果较好。但这种方法对修复的温度和时间要求十分严格。我们常用的高压锅修复，温度在110℃左右，修复时间为2.5min。

b）微波修复是较早采用的热抗原修复技术，其方法受环境因素影响较大。微波修复偶尔也会出现同时修复的组织切片中以及同一切片的不同部位可能会出现修复效果不均匀的现象。比较适合高pH值的抗原修复液（EDTA、EGTA）修复。

c）酶修复法比较温和，常用于脱片现象较严重的切片（如骨组织切片）。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。酶消化法进行抗原修复，须严格控制浓度和作用时间，消化不足，不能充分暴露出组织抗原；过度的消化会破坏组织结构，阳性定位不明确。我们常用蛋白酶K修复，条件为37℃ 10min。

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内源性过氧化物酶会与基质溶液（过氧化氢和显色剂，例如DAB）发生反应，导致假阳性。在与HRP偶联抗体一起孵育之前，先用过氧化氢预处理样本可以显著降低这种非特异性背景。灭活内源性过氧化物酶一般用3%过氧化氢孵育10min左右。

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