酵母裂解酶 20T Zymolyase 20T-其它资料-资讯-生物在线

酵母裂解酶 20T Zymolyase 20T

作者:翌圣生物科技(上海)股份有限公司 2010-08-29T00:00 (访问量:6057)

酵母裂解酶 20T来自藤黄节杆菌

Zymolyase 20T From Arthrobacter luteus

简述

   Zymolyase-20T(酵母裂解酶-20T)是通过Arthrobacter luteus(藤黄节杆菌)深层培养获得的酶制剂,它能有效的裂解活酵母细胞细胞壁。该制剂是利用硫酸铵对培养液的盐析作用获得的冻干粉,其酶活单位是20,000 单位/g.其中主要负责裂解活酵母细胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶,通过对ß-1,3-葡聚糖连接位水解葡萄糖聚合物,释放产物主要是昆布五糖。

产品说明:


单位定义:800nm条件下菌液吸光度下降30%,表示一个活力单位。

特异性:此产品的裂解谱包括以下属的微生物:Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于细胞裂解、原生质球形成及葡聚糖水解。

说明:酵母细胞的裂解程度随酵母菌的种类、生长阶段及培养条件而改变。

声明: Zymolyase是麒麟麦酒股份有限公司(Kirin Brewery Co., Ltd)的注册商标。存:

储存:冻干状态于2-8°C中保存,若30°C下放置3个月约失去70%活力。

外观:冻干粉

活力:20,000单位/g

核心酶:ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶,约1.5 x 106单位 /g

         蛋白酶,约1.0 x 104单位 /g

甘露聚糖酶, 1.0 x 106单位 /g

 淀粉酶,木聚糖酶,***酶,微量DNaseRnase(未检出)

催化剂:二硫苏糖醇(DTT, ß-巯基乙醇及其他的巯基化合物(如半胱氨酸)

最适pH及温度:

     pH 7.5, 35°C裂解活酵母细胞

     pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范围:pH 5-10间保持稳定

热稳定性:60°C5min丧失细胞溶解能力

警告:使用非**纤维滤器过滤除菌

原生质球制备程序:

1.     室温条件,5000rpm3000 xg),5min离心酵母培养物;

2.     收集离心沉淀物(酵母细胞)并记录湿重;

3.     TE缓冲液悬浮细胞,加入量为1.4ml/g湿重细胞;(TE缓冲液配方:100 mM Tris [MP 8196231]pH 8.0100 mM EDTA [MP195173]

4.     双蒸水快速定容,终体积量为3.5ml/g湿重细胞

5.     按照17.5 ul (总体积的1/200)/ g湿重细胞的量加入ß -巯基乙醇(MP 806445),目的是为了除去细胞外层中的甘露聚糖层;

6.     30°C轻摇温育混合液,处于对数期生长的培养物处理15min,处于稳定期生长的培养物处理45min

7.     室温条件,5000rpm离心5min

8.     S缓冲液重新悬浮细胞加入量为4.0ml/g湿重细胞;S缓冲液配方:1.0 M 山梨糖[MP 102938]10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5

9.     5000rpm离心5min

10.  再次用S缓冲液(4.0ml/g湿重细胞)悬浮细胞,另外加入Zymolyases50U /g湿重细胞);如果Zymolyases配制成附录所示的溶液,则添加250ul即可。最好根据实验情况最先优化酶使用量。

11.  30°C轻摇温育混合液30min,根据以下方式监测原生质球形成程度:

(1)       1ul样品到20ul S 缓冲液内,原生质球应该保持完整;

(2)       1ul样品到20ul双蒸水中,原生质球应该破裂;显微镜下观察比较两个样品的形态差异。

12.一般情况下反应45-60min,原生质球的形成量>90%,此时4oC下离心收集细胞,5000rpm5min

13. 再次用S缓冲液(2 ml/g湿重细胞)悬浮原生质球,5000rpm离心5min;重复此步骤做第二次清洗;;

14.原生质球离心沉淀物-70oC冻存。

裂解原生质球获取细胞核:


   温和的裂解原生质球方法如下; 3倍体积的18%FicollMP 160003)溶液悬浮细胞离心沉淀物,Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl2 (MP 195088)10 mM PIPES 缓冲液内,pH 6.5

酵母菌基因组DNA的制备:


 以下步骤快捷,适合于从少量酵母培养物中制备基因组DNA

1.     将过夜培养的10ml酵母菌培养物离心收集细胞,加入280ul TE Buffer(配方见原生质球制备程序中的步骤3),300 ul双蒸水,3 ul ß -巯基乙醇(MP 806445);

2.     30oC温育45min

3.     以台式离心机的最高速度离心2-3s,弃上清液,沉淀物用500 ul S 缓冲液(配方见原生质球制备程序中的步骤8悬浮.;再次离心弃上清;

4.     500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20TMP 32-092-1)的S缓冲液悬浮细胞沉淀物(或者使用自己认为最合适的酶浓度);

5.     30oC温育1小时;

6.     重复步骤3

7.     200 ul含有0.1%SDSMP 190522)和2ug蛋白酶K (MP 809252)TE 缓冲液悬浮细胞沉淀物;

8.     37oC温育3小时,不时的混匀溶液;

9.     调水浴锅的温度至65oC,并温育20min

10.  从水浴锅内取出并冷却至室温;

11.  200ul 1:1Tris饱和酚-氯仿混合液萃取,漩涡混匀并离心;从离心机内取出并保留上清液;

12.  200ul氯仿萃取上清液,之后重复漩涡混匀及离心;

13.  加入500ul95%乙醇到上清液内,20oC沉淀10min

14.  4oC下,15,000 xg离心20 min

15.  自然风干或者于真空离心蒸发浓缩器内晾干除去多余的乙醇,并加入200ul TE缓冲液(含有150 mM NaCl1 ug核糖核酸酶A (MP 101076))溶解DNA;

16.  37oC温育1小时;

17.  重复步骤1112

18.  加入2.5倍体积的95%乙醇20oC沉淀10min

19.  30ul双蒸水重悬DNA。对1:500DNA稀释液测量A260根据消光系数计算DNA产量;

20.

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